De plant is eenjarig , soms meerjarig, kan tot 30 cm hoog worden en wortelt tot 45 cm diep.

De plant heeft een kantige stengel die zich meestal in rechte hoeken vertakt.

De stengels dragen kleine, tegenover elkaar staande blaadjes die langgerekt tot ovaal met een gekartelde rand zijn, ook hebben ze steunblaadjes aan de basis van de stengel, die drie- tot achtlobbig maar soms veerspletig zijn.

Deze steunblaadjes kunnen bijna zo groot zijn als het 'echte' blad.

De eindstandige lob van het steunblaadje is het sterkst ontwikkeld.

De bloeitijd is van mei tot oktober.

De bloemen zijn minstens 1 cm breed, maar meestal breder, gemiddeld 1,5 cm.

De kelkslippen steken er niet buiten uit.

De topslip van de steunblaadjes is verreweg de grootste slip.

Bloemen zijn driekleurig.

Meestal niet effen wit of paars .

De twee rechtopstaande kroonbladen zijn meestal violet. De twee zijdelings naar achteren gebogen kroonbladen neigen wat meer naar blauw.

Het onderste kroonblad is geel of wit gekleurd met een violet vlekje beneden, dat eindigt in een spoor dat met nectar is gevuld.

Het driekleurig viooltje geurt licht.

Het driekleurig viooltje wordt beschermd voor zelfbevruchting doordat een klepje bij het gaatje van de bolvormige stempel het binnenvallen van eigen stuifmeel voorkomt.

Na het rijpen springen de eenhokkige vruchten met drie kleppen open.

Bij het openspringen worden de zaden weggeslingerd.

Ook heeft het zaad een mierenbroodje, waardoor het ook door mieren verspreid wordt.

Driekleurig viooltje is, net als akkerviooltje, traditioneel vooral een soort van graanakkers op niet te zware grond.

Anders dan het wat minder kieskeurige akkerviooltje, groeit driekleurig viooltje vooral op drogere, matig voedselrijke, kalkarme bodems.

Als akkeronkruid doorstond het wellicht minder goed dan haar verwant de grondige transformatie van de moderne bedrijfsvoering in de landbouw.

In het agrarische landschap is driekleurig viooltje vandaag als een gevolg daarvan grotendeels verdrongen naar akkerranden en niet te hoog opschietende, (vrij) schrale bermbegroeiingen op matig voedselrijke bodems.